تست سنجش میزان اندوتوکسین

تست سنجش میزان اندوتوکسین
برای آزادسازی (Release) محصولات دارویی تزریقی، آزمایش اندوتوکسین باکتریایی یکی از پانل آزمایشات ضروری است. بدین منظور توسط مقاماتی مانند سازمان غذا و دارو (FDA)  طبق روش‌های فارماکوپه‌های دارویی تشخیص عوامل تب‌زا به دو شیوه درون‌تنی (In vivo) و برون‌تنی (In vitro) قابل انجام است. در شیوه درون‌تنی، ماده‌ی مورد آزمون به خرگوش تزریق شده و واکنش تب‌زایی در آنها بررسی می‌گردد. در شیوه برون‌تنی، تب‌زا بودن محصولات توسط آزمون LAL مورد بررسی قرار می‌گیرد.

آزمون تب‌زایی درون‌تنی تست پیروژنی  
آزمون تب‌زایی یا بررسی پیروژن بودن محصولات دارویی، نوترکیب و تجهیزات پزشکی در آزمایشگاه مطابق استاندراد فارماکوپه آمریکا (USP) و یا انگلیس (BP) انجام می‌گیرد.
یکی از مهمترین عوامل ایجاد کننده تب در موجودات، لیپو پلی ساکاریدهای (LPS) آزاد شده از دیواره باکتری‌های گرم منفی است که با تحریک سیستم ایمنی در بدن موجودات سبب افزایش دمای بدن یا تب در آنها می‌گردد.
تشخیص عوامل تب‌زا به دلیل اهمیت بالای آن در ایجاد شوک آنافیلاکسی بسیار اهمیت دارد. به منظور تشخیص تب‌زایی، محصولات تولید شده پزشکی، دارویی و نوترکیب آزمون پیروژنی بر روی خرگوش انجام می‌شود تا تب زا بودن آنها مورد بررسی قرار گیرد. در این آزمون مشخص می‌گردد که آیا ماده مورد نظر در بدن به عنوان پیروژن (عامل ایجاد تب) شناخته می‌شود و یا خیر.

آزمون تب‌زایی برون‌تنی تست LAL:
دلیل اینکه آزمایش اندوتوکسین باکتریایی LAL یا آزمایش لیمولوس آمبوسیت نیز نامیده می شود، این است که لیزات سلول های خونی (آمبوسیت ها) از خرچنگ های نعل اسبی (Limulus Polyphemus) به دست می‌آید.
لیزات سلول‌های خون خرچنگ نعل اسبی با اندوتوکسین‌های باکتریایی واکنش نشان می‌دهند.

انواع روش‌های سنجش میزان اندوتوکسین LAL:
سه روش اصلی سنجش اندوتوکسین که بر مبنای روش LAL توسعه یافته‌اند عبارتند از:

1- روش کدورت سنجی ( Turbidimetric method ):
در سنجش اندوتوکسین به روش کدورت‌سنجی، میزان مشخصی از نمونه و محلول LAL در دمای 37 درجه انکوبه شده و میزان کدورت ایجاد شده نسبت به منحنی استاندارد ارزیابی خواهد شد. این روش مشابه روش رنگ سنجی، می تواند به صورت ادامه‌دار ( سنجش کدورت به صورت پیوسته در کل زمان انکوباسیون ) و یا به صورت سنجش در پایان زمان انکوباسیون انجام شود. از معایب روش کدورت سنجی این است که انجام این روش برای ترکیباتی که خود کدورت یا رنگ دارند دشوار یا امکان ناپذیر است.

2-روش ژل کلات ( Chromogenic method ):
روش gel-clot به نظر حساس‌ترین و دقیق‌ترین نوع تست LAL  بوده و کمترین میزان مثبت کاذب نسبت به سایر روش ها در این روش مشاهده شده است. همچنین این روش در فارماکوپه آمریکا، اروپا و ژاپن به عنوان روش استاندارد برای تعیین وجود اندوتوکسین در نمونه دارویی معرفی گردیده است. با این وجود این روش زمان بر بوده و قابلیت انجام اتوماتیک ندارد به همین دلیل در حجم‌های بالای نمونه و امکان ایجاد خطای انسانی این روش توصیه نمی‌شود.